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柚木愈伤组织的EHA105转化条件.doc

柚木愈伤组织的EHA105转化条件

笑笑姚静
2018-04-04 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《柚木愈伤组织的EHA105转化条件doc》,可适用于综合领域

柚木愈伤组织的EHA转化条件柚木愈伤组织的EHA转化条件福建林学院,():JournaofFujianCollegeofForestry第卷第期年月柚木愈伤组织的EHA转化条件曾炳山,裘珍飞,李湘阳,刘英(中国林业科学研究院热带林业研究所,广州龙洞)摘要:对农杆菌EHA转化柚木愈伤组织的适宜条件进行了优化EHA转化柚木愈伤组织的适宜预培养时间为ld,菌液光密度D为一O,共培养时间为d,共培养的pH为EHA共培养对柚木愈伤组织有一定的毒害作用,共培养时间超过Od,可导致愈伤组织和茎段外植体的严重死亡不同无性系对EHA侵染的敏感性不一样,选择适宜的无性系可显着提高转化效率关键词:柚木农杆菌愈伤组织遗传转化中图分类号:QI文献标识码:A文章编号:X()GenetictransformationofteakcallusmediatedbyAgrobacteriumtumefeciensstrainEHAZENGBingshan,QIUZhenffei,LIXiangyang,LIUYing(TheResearchInstituteofTropicalForestry,Guangzhou,Guangdong,China)Abstract:ThegenetictransformationofteakcallusmediatedbyAgrobacteriumtumefeciensstrainEHAwasdiscussedTheoptimumpreculturetimeforcallusinductionofstemsectionexplantsistodays,Dovalueofbacteriuminoculumsolutionisbetweento,coculturetimeistodaysandpHvalueofcoculturemediumistoTheinfectionofEHAistoxictoexplantsandtherewillbehishdeathrateofexplantsifthecoculturetimeislongerthandaysDifferentcloneshavedifferentsusceptibilitytotheinfectionofEHAandcloneswithhishsusceptibilityshouldbeselectedSOthatthetransformationefficiencyofteakcanbegreatlyimprovedKeywords:TectonagrandisAgrobacteriumtumefecienscallusgenetictransformation柚木(TectonagrandisLf)是世界着名的热带珍贵用材树种,生长迅速且材质优良,广泛用于造船,桥梁,建筑,高级家具,高档车厢,雕刻,贴面板和镶贴板等】柚木也是我国热带地区的主要造林和经济树种,我国省多个县(市)有引种栽培,总面积约万多hmL】我国的柚木栽培经常受到土壤酸性,低温冻害,锈病,台风,野螟等问题的困扰J,必须加强常规育种,选育适合于各种立地条件的种源,家系和无性系同时,在常规育种的基础上,开发柚木的转基因技术,研制抗寒,抗虫,抗病,速生的转基因新品种,对于我国柚木的推广栽培也具有重要意义从叶盘,茎段,胚轴,子叶等外植体上诱导愈伤组织,转化愈伤组织,并再生出转基因植株一直以来是植物转基因的重要方法本文优化了柚木茎段愈伤组织的农杆菌转化条件,为柚木转基因技术研究和转基因育种奠定基础材料与方法试验材料采用无性系试管苗的茎段进行愈伤组织诱导,以愈伤组织连同茎段一起做外植体进行转基因参数的优化农杆菌则采用含有双元载体pTiBO和pBI的常用菌株EHA基金项目:中国林业科学研究院科学基金资助项目()作者筒介:曾炳山(一),男,江西井冈山人,副研究员,从事林木组培快繁和基因转化研究收稿日期:修回日期:福建林学院第卷试验方法愈伤组织诱导取具有对叶片,高度为cm的无菌试管苗,切取长度为cm,不带腋芽的茎段,平放在MSBAJl】gL的培养基表面,于诱导茎段的两端产生愈伤组织农杆茵培养先从一低温冰箱中取出保存的农杆菌,涂LB培养基平板,挑取单菌落,进行mL的小体积LB液体培养,再按:的比例接种,进行mL的大体积液体培养繁殖工程农杆菌】平板培养基和液体培养基附加mgL的卡那霉素平板培养,液体培养,共培养的温度均为液体培养的转速为rmin,以rmin离心收集农杆菌,并用柚木愈伤组织诱导的液体培养基重新悬浮,再用于接种和共培养试验设计预培养时间试验设置,,,,,d种处理共培养时间试验设置,,,,d种处理共培养pH试验设置,,,,,,七种处理菌液光密度试验设置,,,,,六种光密度处理,因菌液光密度难以控制且测定光密度烦琐费时,实际处理的光密度略有偏离试验设计采用,,和四个无性系进行农杆菌转化敏感性测定外植体取材部位试验选取每个芽苗最长的节,分上,中,下种部位处理进行试验接种时间试验设置浸泡,,和min种处理卡那霉素试验设置O,,,,,mgL种处理试验重复所有试验的每个处理重复瓶,每瓶个茎段,共个重复由于实际操作中存在一定的污染率,每个处理比预定的重复瓶数增加瓶,以确保每个处理到调查时有足够的瓶数如果没有污染,多余的瓶数则随机去除GUS染色与显微观察参照文献的方法,预培养和共培养结束后即进行GUS染色,染色温度为,时间为h染色后,无水酒精褪色h,每h换次新鲜酒精在实体显微镜下放大倍观察,统计蓝斑的数量试验观测调查指标有愈伤组织蓝斑数,茎段表皮蓝斑数,愈伤组织颜色,愈伤组织重量,愈伤组织死亡率和茎段外植体死亡率等正常的柚木愈伤组织为白色,淡绿色或淡黄色,愈伤组织变成黑褐色和水浸状时视为死亡正常茎段的表皮颜色为绿色或淡绿色,茎段变成深黄色或褐色时视为死亡结果与分析预培养时间外植体预培养时间是农杆菌转化植物细胞的重要技术参数之一,预培养使得外植体的细胞处于旺盛的细胞分裂和生长状态,从而容易被农杆菌转化叫从表可以看出,愈伤组织的蓝斑数量从预培养d的个茎段一,逐渐增加至d的个茎段,,d的蓝斑数量达到最大值,而超过d,蓝斑数量呈下降趋势EHA转化柚木愈伤组织时以预培养d为佳愈伤组织的有斑率从d的升至d的后则基本稳定在一表不同预培养时间EHA对愈伤组织的转化效率TableTrans~ormationefficiencyofEHAtocloneBcallusatdifferentpre~culturetime第期曾炳山等:柚木愈伤组织的EHA转化条件除转化愈伤组织外,EHA还转化茎段的表皮细胞,平均每个茎段的表皮蓝斑数为个随着预培养时间的增长,茎段表皮细胞的转化效率呈明显下降趋势,可能是茎段的内部营养逐渐用于形成愈伤组织,活力逐渐下降的缘故共培养过程中,也发现随着预培养时间的延长和愈伤组织的萌发与增大,茎段表皮由绿色逐渐转变为淡绿色或浅黄色接种时间接种浸泡时间过短,农杆菌尚未接触或接种到外植体表面,共培养时无农杆菌生长,不能转化接种浸泡时间过长,外植体常因农杆菌毒害而软腐EHA转化愈伤组织时,接种时间为rain,愈伤组织的蓝斑数量逐步提高因此,适宜于柚木愈伤组织转化的接种时间约为min表不同接种时间EHA对愈伤组织的转化效率TableTransformationefficiencyofEHAtoclonecallusatdifferentinoculationtime共培养时间共培养时间也是农杆菌转化植物细胞的重要技术参数之一农杆菌接受植物信号,切下TDNA,包装TDNA,穿过植物细胞壁和细胞膜,通过细胞质进入细胞核,并整合到染色体上至少需要hl因细胞结构的差异,释放的受伤信号强弱不同,忍受农杆菌危害的能力不同,不同植物最适宜的共培养时间差异比较大愈伤组织与EHA共培养的时间少于d时,愈伤组织蓝斑数低于个茎段,,共培养d时愈伤组织蓝斑数升至最大值,但超过lld蓝斑数量开始下降因此共培养天数以d为好,茎段愈伤组织蓝斑数量最多,愈伤组织有蓝斑的百分率也最高农杆菌EHA对茎段表皮细胞的转化也需要d以上,d共培养时间则茎段表皮极少有蓝斑表不同共培养时间EHA对愈伤组织的转化效率TableTranfformationefficiencyofEHAI~todonecallusatd~erentc一culturetime共培养时间过长,农杆菌过度生长,植物细胞因遭受农杆菌毒害而死亡茎段与EHA共培养d,愈伤组织即有的死亡率,茎段死亡率为,共培养d后愈伤组织死亡率达到,茎段死亡率达到,共培养d后愈伤组织死亡率达到,茎段死亡率则高达O因此,EHA的生长和侵染对柚木愈伤组织和茎段具有一定的毒性,共培养时间应少于d共培养pHEHA对无性系愈伤组织的转化效率随pH值的减小而降低,pH值低于时转化效率显着下降茎段愈伤组织蓝斑数的方差分析结果显示,pH值为差异不显着,但显着高于pH值为因此,适宜于EHA转化柚木愈伤组织的共培养pH为EHA对茎段表皮细胞转化则需要低的pH值为适宜于EHA转化表皮细胞的pH值与转化愈伤组织的pH值有明显的差异福建林学院,第卷菌液光密度处于对数生长期的农杆菌转化效率最高,但对数生长初期的菌液浓度比较小,农杆菌个体数量不足光密度是菌液浓度的最好指标,当菌液光密度D鲫小于时,农杆菌个体数量不足光密度超过后,培养基的养分和氧气供应不足,农杆菌菌液中死亡个体的比例增加,多数情况下不适宜于转化LJEHA转化的结果表明,光密度为,茎段愈伤平均蓝斑数比较高,愈伤组织有蓝斑率也高,为适宜的菌液浓度范围茎段表皮细胞的转化率则在光密度为均比较高表不同光密度D鲫EHA对愈伤组织的转化效率TableTransformationefficiencyofERAtoclonescallusatdifferentDco皿values无性系与取材部位不同基因型或无性系对农杆菌的侵染具有不同的敏感性EHA对,和三个无性系愈伤组织具有较高的转化效率,而茎段表皮细胞的转化频率则比较低与其它个无性系相反,愈伤组织的转化效率低,而茎段表皮细胞的转化效率高,蓝斑数量显着高于其它个无性系因此,不同无性系对农杆菌的侵染和转化有不同的敏感性,应选择敏感的无性系开展柚木转基因研究表EHA对不同无性系愈伤组织的转化效率TableTransformationefficiencyofEHAtocallusofdifferentclones第期曾炳山等:柚木愈伤组织的EHA转化条件柚木组培苗的个体比较大,高度可达cm,节数个中间节的长度最大,占整个苗木高度的以上选取每个芽苗最长节进行转化,结果表明,上,中,下节的愈伤诱导率,愈伤组织转化率和茎段表皮细胞转化率均有明显的变化趋势上部茎段容易诱导出愈伤组织,两端的愈伤组织诱导率均比中,下部茎段高,下部茎段两端的愈伤组织诱导率均最低另外,种茎段均容易在基部方向的下端形成愈伤组织,下端的愈伤组织诱导率为,而上端则仅有茎段取材部位对转化效率的影响趋势也比较明显上部茎段的愈伤因诱导率,愈伤组织转化率,平均蓝斑数均最高,中部茎段居中,下部茎段最低然而,表皮细胞的转化效率却相反,下部茎段最高,上部茎段最低讨论在植物外植体的转化过程中,共培养时间长,农杆菌过度生长会对植物细胞产生毒害作用导致植物组织的死亡和转化效率的降低水稻,棉花,马铃薯,黄瓜,西瓜,甜瓜,烟草,甘薯,苜蓿,亚麻,花生,豌豆,生菜等许多农作物的最适共培养时间为dJ,桉树,木麻黄,杨树,白桦等多数林木也是d卜柚木愈伤组织对农杆菌的过度生长和毒害具有一定的耐性,与EHA共培养的适宜时间为d,比常见植物种类的d多dpH值对农杆菌陆区基因的活化和表达有显着的影响,当培养基的pH低于时比较适宜于农杆菌基因的诱导表达,pH值为时基因的诱导达到最高水平J柚木是一种不耐酸性的树种,土壤的pH值为左右时最适宜于生长】柚木外植体的愈伤组织诱导和增殖培养适宜的培养基pH值也比较高,为因此,选择合适的共培养pH值,既满足农杆菌区基因活化的要求,又适宜于愈伤组织的生长成了转化条件优化的关键之一研究结果表明,柚木愈伤组织的转化效率随pH值的减小而降低,pH值低于时转化效率显着下降,适宜于EHA转化愈伤组织的共培养pH值为,比其它植物种类要求的以下略高j多数林木的再生频率低,严重影响了遗传转化研究,即使有些林木种类的再生频率比较高,但却仅限于幼胚,子叶,上胚轴,下胚轴等幼嫩的外植体林木育种多是走无性系育种的道路,栽培上使用的良种绝大多数是无性系用幼胚,子叶,上胚轴,下胚轴等有性材料进行转基因育种,无法保持无性系的所有优良特性因此,现有转基因技术还无法直接在常规育种的基础上进行转基因育种对于柚木而言,愈伤组织的再生效率非常低,只有来自茎段的愈伤组织能够以器官再生的形式低频率地再生,因而本研究选择来源于茎段的愈伤进行转基因条件的优化王关林等认为,由于植物基因转化的频率较低,一般情况下只有的转化率,而且农杆菌的侵染,抗生素的筛选等转基因操作,可使再生效率进一步降低,甚至完全不能再生,因此受体系统必须具有高频的再生率,最好大于贾士荣'也认为,用于基因转化的受体系统应该具有一的再生频率,并且每块外植体能再生出丛芽目前柚木外植体的再生率低,再生配方有待于进一步优化,只有达到一定的再生频率,才能保证转基因的效率,否则难以获得足够数量的柚木转基因植株致谢:本研究的无性系材料由热带林业研究所的梁坤南研究员提供,特此致谢参考文献:周铁烽中国热带主要经济树木栽培技术J北京:林业出版社,福建林学院第卷马华明,梁坤南,周再知我国柚木的研究与发展J林业科学研究,,():郑飞翔,温达志,旷远文模拟酸雨对柚木幼苗生长,光合与水分利用的影响J热带亚热带植物,,():叶功富,朱世威,罗幼宁闽南丘陵山地引种栽培树木的物候期与抗寒力调查J亚热带植物科学,,():邝炳朝,郑椒珍抗锈病,号柚木种源的选择J林业科学研究,,():王平远,宋士美柚木螟的分类及一新属J昆虫,,():梁坤南,自嘉雨,周再知,等珍贵树种柚木良种繁育发展概况J广东林业科技,,():王关林,方宏筠植物基因工程M北京:科学出版社,PalM,DanielFK,AnthonyRC,eta植物分子生物实验指南M刘进远,吴庆余,译北京:科学技术出版社,闫新甫转基因植物M北京:科学出版社,MoralejoM,RoehangeF,BoudetAM,etaLGenerationoftranagenieEucalyptusglobulusplantletsthroughAgrobacteriumtumefaeiensmediatedtransformationJAustralianJournalofPlantPhysiology,,():'HoCK,ChangSH,TsayJY,etaLAgrobacteriumtumefaeiensmediatedtransformationofEucalyptuscamaldulenslsandproductionoftransgenieplantsJPlantCellReports,,():PhelepM,PetitA,MartinL,etaTransformationandregenerationofanitrogenfixingtree,AllocasuarinavertidllataLamJBioTechnology,,():LeQV,BoguszD,GherbiH,etaAgrobacteriumtumefaeiensgenetransfertoCasuarqnaglauca,atropicalnitrogenfixingJPlantScience(Limerick),,():韩琳娜,周春江,崔德才,等转G基因黑杨植株的获得J山东农业大学:自然科学版,,():詹亚光,王玉成,王志英,等白桦的遗传转化及转基因植株的抗虫性J植物生理与分子生物学,,():贾士荣农杆菌介导的植物遗传转化M北京:农科院生物技术中心出版社,(责任编校:江英)

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